Chromatographie sur couche mince

1 En théorie

La chromatographie est une technique basée sur l'affinité des composés extraits pour la phase fixe et la phase mobile, c'est ce que l'on va détailler ici.

Pour parvenir à la séparation, on effectue la chromatographie sur une plaque de gel de silice (la silice est un "sable" spécial composé de SiO₂) qui constitue la phase fixe sur laquelle vont se déplacer les composés à séparer. On peut également utiliser en lieu et place de la silice des plaques de cellulose ou du papier Whatman pour chromatographie. On choisira en fonction des composés à séparer et des éventuelles méthodes de révélations voulues.

Pour aider les composés à se déplacer, on fait migrer par capillarité un solvant, appelé alors "éluant", qui constitue ainsi la phase mobile.

Une petite quantité du mélange à analyser est déposée sur un support (phase fixe), et est entraînée par l'éluant (phase mobile).

Selon leur affinité, les substances sont plus ou moins retenues par la phase fixe, ce qui rend leur séparation possible. On appelle ce processus "élution".

En théorie, une substance déposée sur un support et entraînée par un certain éluant, se déplacera exactement à la même vitesse que la même substance déposée sur un autre support exactement identique et entraînée par le même éluant. Ceci permet de comparer une substance contenue dans un mélange (par exemple, un milieu réactionnel) avec une substance pure (par exemple, le réactif limitant de la réaction).

2 Choix de l'éluant

L'éluant doit être chimiquement inerte avec le mélange à séparer. Cela ne pose généralement pas de problème avec les solvants usuels.

Pour trouver le bon éluant, ou mélange d'éluants, on effectue des tests préliminaires.

2.1 Technique microcirculaire

Pour gagner du temps et ne pas gaspiller des plaques de chromatographie, on utilisera souvent la "technique microcirculaire".

Cela consiste à spoter la solution de l'échantillon sur une plaque CCM et, à l'aide d'un capillaire, ajouter lentement le solvant testé.

L'échantillon est élué et, lorsque la plaque est révélée (bien sûr, on fera plusieurs tests avant de révéler la plaque), on peut constater une bonne ou mauvaise séparation par rapport au solvant utilisé.

Une bonne séparation donnera des cercles distincts et les plus fins possible.

Si l'on n'obtient pas de bons résultats avec un solvant pur, on pourra également essayer avec des mélanges de solvants. On utilise comme éluants des mélanges de deux solvants ou plus, de polarité différente.

2.2 Technique basée sur les rapports frontaux et la force d'élution

Voir la page concernant cette méthode : Optimisation de mélange d'éluants pour CCM

3 Cuve de développement

La cuve de développement est un récipient en verre muni d'un couvercle. Un pot de confiture fait l'affaire.

L'éluant est versé dans la cuve sur une hauteur ne dépassant pas 1cm, afin que l'endroit où la substance a été appliquée ne soit pas plongé dans l'éluant.

La cuve est alors fermée, et on attend une demi-heure pour que le système soit saturé en vapeurs de solvant. Si on ne veut pas attendre, on peut ajouter un papier filtre qui sera plaqué contre la paroi et plongé dans l'éluant. L'éluant montant par capillarité, la surface d'évaporation augmente radicalement et la cuve est rapidement saturée. Ceci afin d'éviter une évaporation directement sur la plaque de chromatographie, ce qui provoquerait une perturbation du flux de l'éluant dans les bords de la plaque. La distance parcourue par les substances serait alors plus grande au bord qu'au milieu

4 En pratique

Les supports les plus utilisés sont des plaques recouvertes de silice, et dans une moindre mesure celles recouvertes de cellulose.

Au crayon papier, on trace deux lignes perpendiculaires à la longueur de la plaque, à environ 1,5 cm de chaque extrémité. Il faut faire attention à ne pas endommager la silice.

L'une de ces lignes, celle du bas, sera le "start". C'est sur cette ligne qu'on déposera le mélange et les références.

Pour ce faire, on dissout en général les échantillons dans un solvant de façon à obtenir une concentration de 0,1 à 5%. Ce solvant doit être chimiquement inerte, pur, et le plus volatil possible.

Les solutions obtenues sont déposées sur le start à l'aide de capillaires, ou simplement avec une pipette pasteur (cela demande un peu plus d'entraînement). Les dépôts d'échantillons (spots) doivent être aussi petits que possible. Leur position devra être soigneusement marquée au crayon.

La ligne du haut est le "front d'élution". Lorsque l'éluant aura atteint cette ligne, il faudra stopper la CCM et sécher la plaque. Ainsi, on pourra comparer la distance parcourue par la substance sur la distance parcourue par l'éluant, et obtenir une valeur appelée "R_f" (Retention factor). Le R_f n'est pas une valeur propre à chaque substance ! Cette valeur permet juste de comparer rapidement deux substances éluées sur la même plaque.

5 La révélation

La révélation est l'étape qui permet de visualiser de manière aisée la position des taches (issues du déplacement des constituants des mélanges déposés sur la plaque) obtenues en fin d'élution et après séchage de la plaque.

Toutes les substances n'étant pas colorées, ou faiblement colorées, les taches peuvent être invisibles sur la plaque. Parmi les méthodes de révélation des plaques, on utilise la révélation aux UV et l'utilisation de réactifs chimiques.

5.1 Révélation aux UV

Les plaques de chromatographie sur couche mince actuellement sont vendues avec des indicateurs, déjà déposés à la surface de la plaque, qui permettent une révélation aux ultraviolets (UV) (254 ou 366 nm), c'est le plus souvent du silicate de zinc activé au manganèse ^[1]

Les UV 254 provoquent en effet une fluorescence vert clair lumineux de cet indicateur. Ainsi, les substances absorbant les UV empêcheront ces derniers d'atteindre la plaque et l'indicateur. On visualisera alors le spot comme un endroit ne présentant aucune fluorescence (le spot apparaîtra en violet).

Pour les substances fluorescentes, on utilisera généralement les UV 366. Les spots apparaîtront fluorescents, contrairement à la plaque qui restera violette.

5.2 Révélation avec des réactifs

On utilise divers réactifs qui vont former des taches colorées avec les substances déposées sur la plaque. L'avantage est qu'il existe des réactifs spécifiques de certaines fonctions organiques, ou familles de substances.

Par exemple, pour des substances à liaisons aliphatiques insaturées, on peut exposer la plaque CCM à des vapeurs d'iode . Les substances apparaîtront alors sous forme de taches brunes.

Pour une liste très complète de réactifs, consulter le document (en anglais) Dyeing Reagents for Thin-Layer and Paper Chromatography (téléchargement depuis le site du CCCM).

6 Voir aussi

• Expérience facile à réaliser pour illustrer la CCM : Chromatographie de feutres sur papier buvard
• Optimisation de mélange d'éluants pour CCM

7 Références

1. ↑ http://en.wikipedia.org/wiki/Thin_layer_chromatography

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 Constitution d'une plaque de CCM

Une plaque de CCM est un support en verre, en aluminium ou en plastique sur lequel a été étalé une phase stationnaire en couche uniforme. L'épaisseur de cette couche est de l'ordre de 0,2 mm (200 μm) pour une plaque analytique et 1-3 mm pour une plaque préparative. Avant étalement, la phase stationnaire est une poudre fine et elle doit donc être mélangée à un liant qui assure la bonne cohésion de la couche et une bonne adhérence au support. On utilise le plus fréquemment un liant inorganique comme du gypse, du plâtre, du sulfate de calcium hémihydraté, ou un liant organique (par exemple l'alcool polyvinylique) notamment lorsque la phase stationnaire est hydrophobe.

On ajoute souvent un pigment fluorescent pour permettre une détection des produits à la lumière ultraviolette à 254 nm ou 366 nm ; à cette longueur d'onde, le pigment de la phase stationnaire émet une lumière, verte en général, sauf aux endroits où un produit absorbe le rayonnement UV ce qui provoque l'apparition de taches sombres.

Mode opératoire

L'exemple ci-dessous montre les différentes étapes de la procédure pour la préparation, l'élution et la révélation de plaques de CCM pendant le suivi de l'avancement d'une réaction chimique. On considère que la phase stationnaire est un gel de silice standard comportant un indicateur fluorescent.

Chaque trait est à écrire au crayon à papier, car les encres des plumes ou des stylos sont solubles dans la plupart des éluants, donc fausseraient la chromatographie.

• On trace un trait horizontal (la ligne de base) à environ 1 cm du bas de la plaque de CCM. Les marques D, B et M représentent respectivement le produit de Départ, le Brut réactionnel et le point Mixte (un mélange de D et B). Le point mixte permet de mieux visualiser les taches lorsqu'elles sont très proches ou lorsque l'étape d'élution est imparfaite.
• On dépose, à l'aide d'un capillaire ou d'une microseringue, une petite quantité d'une solution du produit de départ sur les marques D et M et une petite quantité du brut réactionnel sur les marques B et M. Dans cet exemple, le produit de départ est incolore (cercle en pointillé) alors que le brut réactionnel est légèrement coloré.
• On prépare à côté, un éluant qui recouvrira le fond de la cuve sur environ 5mm de hauteur, et on laisse saturer la cuve. (C'est-à-dire : laisser la cuve fermée et laisser les vapeurs de l'éluant 'remplir' le volume de la cuve, environ 5-10 min).
• On place la plaque de CCM dans la cuve contenant l'éluant. Le solvant monte le long de la plaque par capillarité. Lorsqu'il arrive presque en haut de la plaque, on sort celle-ci de la cuve, on marque la ligne de front (là où l'éluant s'est arrêté de migrer) et on laisse l'éluant s'évaporer. Ici, on ne voit que les taches 3 et 5 puisque les autres sont incolores. On observe que la tache 5 n'a que très légèrement migré au-dessus de la ligne de base.
• Pour visualiser les différentes taches, on commence par placer la plaque sous une lampe UV à 254 nm. La plaque apparaît en vert fluorescent et les produits qui absorbent les UV apparaissent sous forme de taches sombres. On utilise cette méthode de détection en priorité car elle n'endommage pas la plaque. Dans cet exemple, on voit que le brut réactionnel contient encore du produit de départ (tache 4) mais la taille de la tache indique qu'il y en a moins qu'en début de réaction. On observe la formation d'au moins trois nouveaux produits (1, 2 et 5) : 1 et 2 sont moins polaires que le produit de départ, et 5 est plus polaire. Il semble que le produit 5 est majoritaire dans le brut réactionnel (le produit 2 est beaucoup moins visible) mais tous les produits ne révèlent pas avec la même intensité aux UV.
• On plonge la plaque dans une solution acide de vanilline (il existe de nombreux autres révélateurs) et l'on chauffe la plaque jusqu'à ce que des taches colorées apparaissent. Ici on observe un autre produit (3) qui n'était pas visible aux UV. La tache 1 est à peine visible ; elle l'était beaucoup plus sous lampe UV. La surprise vient de la tache 2 : elle n'était que faiblement visible en UV mais elle révèle très intensément avec la vanilline. Il est fort possible que ce soit le produit majoritaire de la réaction et non le produit 5 comme le laissait supposer la détection UV.

Conclusion : il se produit bien quelque chose lors de cette réaction chimique. Plusieurs produits sont formés mais l'un (n°2) semble nettement majoritaire. Il faudra refaire une CCM un peu plus tard pour suivre la disparition de la tache 4 (produit de départ) dans la colonne B (brut réactionnel) ce qui signifiera que la réaction est terminée. Ensuite, une chromatographie sur colonne permettra d'isoler les différents produits et d'effectuer des analyses plus poussées pour s'assurer que le produit 2 est bien le produit attendu.

Migration des espèces chimiques

La distance de migration des produits dépend de leur affinité avec la phase stationnaire et la phase mobile. Dans l'exemple d'une phase stationnaire polaire (ex : le gel de silice) et une phase mobile apolaire (ex : hexane), les produits polaires auront tendance à peu migrer, voire pas du tout alors que les produits apolaires migreront davantage car entrainés par l'éluant apolaire. Les analytes passent régulièrement d'une phase à l'autre durant l'élution. L'affinité joue sur le temps de séjour des analytes dans chaque phase, plus ils ont d'affinité avec la phase stationnaire, plus ils vont y passer du temps, leur temps de rétention total va donc être rallongé.

L'éluant peut être parfois un mélange d'un produit polaire et d'un produit apolaire (par exemple : dichlorométhane/hexane), ce qui permet de faire légèrement migrer même les espèces qui ont une affinité avec la phase stationnaire. Ceci a pour utilité d'éviter que plusieurs produits soient confondus sur la ligne de base.

La migration dépend aussi de l'affinité du solvant (polaire, apolaire) avec la phase stationnaire et la phase mobile.

Elle dépend également de la concentration de l'espèce.

Les sels ou autres édifices ioniques ne migrent en général pas du tout et restent sur la ligne de base.

Rapport frontal

Le rapport frontal d'un composé est le rapport de la distance ligne de dépôt-composé sur la distance ligne de dépôt-front de solvant. Il est compris entre 0 et 1, et est caractéristique du composé, du matériau de la plaque et du système d'éluant.

Révélateurs

lien vers le site du Club de Chromatographie sur Couche Mince : http://www.clubdeccm.com/PDF/Dyeing_Reagents_TLC.pdf ce document PDF très complet donne une description exhaustive (appuyée de références bibliographiques) de 335 révélateurs.

Révélation au permanganate de potassium

• 10 g de K₂CO₃
• 1,5 g de Permanganate de potassium (KMnO₄)
• 150 ml d'eau distillée
• 1,25 ml d'Hydroxyde de sodium (NaOH) en solution à 10 %

Astuces

Eviter la marque au front de migration

Bien souvent, les plaques commerciales sont recouvertes d'un produit (gel de silice), qui vient perturber la révélation. En effet, on se retrouve bien souvent avec une ligne au niveau de ce front. Elle est souvent considérée (à tort) comme la marque des solvants utilisés. Mais une méthode simple pour eviter ce phénomène est de faire migrer intégralement la plaque dans le système de solvant que l'on va utiliser par la suite et de la laisser bien sécher avant utilisation. L'avantage principal de cette technique est de permettre de voir plus clairement si des produits ont migré sans être retenus par la phase solide.

Affiner les dépôts

Un dépôt idéal est une ligne fine faite en une seule fois. Cependant, en fonction de l'origine du produit déposé, cela n'est pas forcément facile. On peut utiliser un solvant fort (acétone/méthanol 90:10 sur de la silice par exemple) que l'on va utiliser pour faire migrer l'intégralité la fraction déposée et ce seulement sur quelques millimètres. Ainsi on se retrouve bien souvent avec une ligne bien nette ce qui permet de discriminer plus facilement des produits ayant des comportements relativement proches sur la plaque. Il faut par contre s'assurer séchage complet de la plaque avant de poursuivre avec le développement.

Découpage d'une plaque souple

Les plaques sur support souple sont faites pour être découpées. Cependant, la phase solide se détache facilement de ce support, et au moment de la découpe s'émiette provoquant ainsi divers artefacts lors du développement de la plaque (effets de bord dans lesquels un côté de la plaque va migrer plus vite que l'autre). Pour éviter cela, lors de la découpe, on peut pencher les ciseaux à 45° dans le sens des aiguilles d'une montre (pour des ciseaux droitiers, l'inverse pour des gauchers) dans l'axe de la découpe.