1 En théorie
La
chromatographie est une technique basée sur l'affinité des composés extraits
pour la phase fixe et la phase mobile, c'est ce que l'on va détailler ici.
Pour
parvenir à la séparation, on effectue la chromatographie sur une plaque de gel
de silice (la silice est un "sable" spécial composé de SiO2)
qui constitue la phase fixe sur laquelle vont se déplacer les composés à
séparer. On peut également utiliser en lieu et place de la silice des plaques
de cellulose ou du papier Whatman pour chromatographie. On choisira en fonction
des composés à séparer et des éventuelles méthodes de révélations voulues.
Pour aider
les composés à se déplacer, on fait migrer par capillarité un solvant, appelé
alors "éluant", qui constitue ainsi la phase mobile.
Une petite
quantité du mélange à analyser est déposée sur un support (phase fixe), et est
entraînée par l'éluant (phase mobile).
Selon leur
affinité, les substances sont plus ou moins retenues par la phase fixe, ce qui
rend leur séparation possible. On appelle ce processus "élution".
En théorie,
une substance déposée sur un support et entraînée par un certain éluant, se
déplacera exactement à la même vitesse que la même substance déposée sur un
autre support exactement identique et entraînée par le même éluant. Ceci permet
de comparer une substance contenue dans un mélange (par exemple, un milieu
réactionnel) avec une substance pure (par exemple, le réactif limitant de la
réaction).
2 Choix de l'éluant
L'éluant
doit être chimiquement inerte avec le mélange à séparer. Cela ne pose
généralement pas de problème avec les solvants usuels.
Pour trouver
le bon éluant, ou mélange d'éluants, on effectue des tests préliminaires.
2.1 Technique microcirculaire
Pour gagner
du temps et ne pas gaspiller des plaques de chromatographie, on utilisera
souvent la "technique microcirculaire".
Cela
consiste à spoter la solution de l'échantillon sur une plaque CCM et, à l'aide
d'un capillaire, ajouter lentement le solvant testé.
L'échantillon
est élué et, lorsque la plaque est révélée (bien sûr, on fera plusieurs tests
avant de révéler la plaque), on peut constater une bonne ou mauvaise séparation
par rapport au solvant utilisé.
Une bonne
séparation donnera des cercles distincts et les plus fins possible.
Si l'on
n'obtient pas de bons résultats avec un solvant pur, on pourra également
essayer avec des mélanges de solvants. On utilise comme éluants des mélanges de
deux solvants ou plus, de polarité différente.
2.2 Technique basée sur les rapports frontaux et la
force d'élution
Voir la page
concernant cette méthode : Optimisation de mélange d'éluants pour CCM
3 Cuve de développement
La cuve de
développement est un récipient en verre muni d'un couvercle. Un pot de confiture
fait l'affaire.
L'éluant est
versé dans la cuve sur une hauteur ne dépassant pas 1cm, afin que l'endroit où
la substance a été appliquée ne soit pas plongé dans l'éluant.
La cuve est
alors fermée, et on attend une demi-heure pour que le système soit saturé en
vapeurs de solvant. Si on ne veut pas attendre, on peut ajouter un papier
filtre qui sera plaqué contre la paroi et plongé dans l'éluant. L'éluant
montant par capillarité, la surface d'évaporation augmente radicalement et la
cuve est rapidement saturée. Ceci afin d'éviter une évaporation directement sur
la plaque de chromatographie, ce qui provoquerait une perturbation du flux de
l'éluant dans les bords de la plaque. La distance parcourue par les substances
serait alors plus grande au bord qu'au milieu
4 En pratique
Les supports
les plus utilisés sont des plaques recouvertes de silice, et dans une moindre
mesure celles recouvertes de cellulose.
Au crayon
papier, on trace deux lignes perpendiculaires à la longueur de la plaque, à
environ 1,5 cm de chaque extrémité. Il faut faire attention à ne pas endommager
la silice.
L'une de ces
lignes, celle du bas, sera le "start". C'est sur cette ligne qu'on
déposera le mélange et les références.
Pour ce
faire, on dissout en général les échantillons dans un solvant de façon à
obtenir une concentration de 0,1 à 5%. Ce solvant doit être chimiquement
inerte, pur, et le plus volatil possible.
Les
solutions obtenues sont déposées sur le start à l'aide de capillaires, ou
simplement avec une pipette pasteur (cela demande un peu plus d'entraînement).
Les dépôts d'échantillons (spots) doivent être aussi petits que possible. Leur
position devra être soigneusement marquée au crayon.
La ligne du
haut est le "front d'élution". Lorsque l'éluant aura atteint cette
ligne, il faudra stopper la CCM et sécher la plaque. Ainsi, on pourra comparer
la distance parcourue par la substance sur la distance parcourue par l'éluant,
et obtenir une valeur appelée "Rf" (Retention factor). Le
Rf n'est pas une valeur propre à chaque substance ! Cette
valeur permet juste de comparer rapidement deux substances éluées sur la même
plaque.
5 La révélation
La
révélation est l'étape qui permet de visualiser de manière aisée la position
des taches (issues du déplacement des constituants des mélanges déposés sur la
plaque) obtenues en fin d'élution et après séchage de la plaque.
Toutes les
substances n'étant pas colorées, ou faiblement colorées, les taches peuvent
être invisibles sur la plaque. Parmi les méthodes de révélation des plaques, on
utilise la révélation aux UV et l'utilisation de réactifs chimiques.
5.1 Révélation aux UV
Les plaques
de chromatographie sur couche mince actuellement sont vendues avec des
indicateurs, déjà déposés à la surface de la plaque, qui permettent une
révélation aux ultraviolets (UV) (254 ou 366 nm), c'est le plus souvent du
silicate de zinc activé au manganèse [1]
Les UV 254 provoquent
en effet une fluorescence vert clair lumineux de cet indicateur. Ainsi, les
substances absorbant les UV empêcheront ces derniers d'atteindre la plaque et
l'indicateur. On visualisera alors le spot comme un endroit ne présentant
aucune fluorescence (le spot apparaîtra en violet).
Pour les
substances fluorescentes, on utilisera généralement les UV 366. Les spots
apparaîtront fluorescents, contrairement à la plaque qui restera violette.
5.2 Révélation avec des réactifs
On utilise
divers réactifs qui vont former des taches colorées avec les substances
déposées sur la plaque. L'avantage est qu'il existe des réactifs spécifiques de
certaines fonctions organiques, ou familles de substances.
Par exemple,
pour des substances à liaisons aliphatiques insaturées, on peut exposer la
plaque CCM à des vapeurs d'iode 
. Les substances apparaîtront alors sous
forme de taches brunes.
Pour une liste
très complète de réactifs, consulter le document (en anglais) Dyeing
Reagents for Thin-Layer and Paper Chromatography (téléchargement depuis le
site du CCCM).
6 Voir aussi
- Expérience
facile à réaliser pour illustrer la CCM : Chromatographie de feutres
sur papier buvard
- Optimisation
de mélange d'éluants pour CCM
7 Références
- ↑
http://en.wikipedia.org/wiki/Thin_layer_chromatography
Catégories :
- Chimie
- Techniques
de laboratoire
- Analyse
- Organique
- Page
- Discussion
- Voir le
texte source
- Historique
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Constitution
d'une plaque de CCM
Une plaque
de CCM est un support en verre, en aluminium ou en plastique sur lequel a été
étalé une phase stationnaire en couche uniforme. L'épaisseur de cette couche
est de l'ordre de 0,2 mm (200 μm) pour une plaque analytique et 1-3 mm
pour une plaque préparative. Avant étalement, la phase stationnaire est
une poudre fine et elle doit donc être mélangée à un liant qui assure la bonne
cohésion de la couche et une bonne adhérence au support. On utilise le plus
fréquemment un liant inorganique comme du gypse, du plâtre, du sulfate de
calcium hémihydraté, ou un liant organique (par exemple l'alcool polyvinylique)
notamment lorsque la phase stationnaire est hydrophobe.
On ajoute
souvent un pigment fluorescent pour permettre une détection des produits à la
lumière ultraviolette à 254 nm ou 366 nm ; à cette longueur d'onde, le
pigment de la phase stationnaire émet une lumière, verte en général, sauf aux
endroits où un produit absorbe le rayonnement UV ce qui provoque l'apparition
de taches sombres.
Mode
opératoire
L'exemple
ci-dessous montre les différentes étapes de la procédure pour la préparation,
l'élution et la révélation de plaques de CCM pendant le suivi de l'avancement
d'une réaction chimique. On considère que la phase stationnaire est un gel de
silice standard comportant un indicateur fluorescent.
Chaque trait
est à écrire au crayon à papier, car les encres des plumes ou des stylos sont
solubles dans la plupart des éluants, donc fausseraient la chromatographie.
- On
trace un trait horizontal (la ligne de base) à environ 1 cm du bas
de la plaque de CCM. Les marques D, B et M représentent respectivement le
produit de Départ, le Brut réactionnel et le point Mixte (un
mélange de D et B). Le point mixte permet de mieux visualiser les taches
lorsqu'elles sont très proches ou lorsque l'étape d'élution est
imparfaite.
- On
dépose, à l'aide d'un capillaire ou d'une microseringue, une petite
quantité d'une solution du produit de départ sur les marques D et M et une
petite quantité du brut réactionnel sur les marques B et M. Dans cet
exemple, le produit de départ est incolore (cercle en pointillé) alors que
le brut réactionnel est légèrement coloré.
- On
prépare à côté, un éluant qui recouvrira le fond de la cuve sur environ
5mm de hauteur, et on laisse saturer la cuve. (C'est-à-dire : laisser
la cuve fermée et laisser les vapeurs de l'éluant 'remplir' le volume de
la cuve, environ 5-10 min).
- On
place la plaque de CCM dans la cuve contenant l'éluant. Le solvant monte
le long de la plaque par capillarité. Lorsqu'il arrive presque en haut de
la plaque, on sort celle-ci de la cuve, on marque la ligne de front (là où
l'éluant s'est arrêté de migrer) et on laisse l'éluant s'évaporer. Ici, on
ne voit que les taches 3 et 5 puisque les autres sont incolores. On
observe que la tache 5 n'a que très légèrement migré au-dessus de la ligne
de base.
- Pour
visualiser les différentes taches, on commence par placer la plaque sous
une lampe UV à 254 nm. La plaque apparaît en vert fluorescent et les
produits qui absorbent les UV apparaissent sous forme de taches sombres.
On utilise cette méthode de détection en priorité car elle n'endommage pas
la plaque. Dans cet exemple, on voit que le brut réactionnel contient
encore du produit de départ (tache 4) mais la taille de la tache indique
qu'il y en a moins qu'en début de réaction. On observe la formation d'au
moins trois nouveaux produits (1, 2 et 5) : 1 et 2 sont moins
polaires que le produit de départ, et 5 est plus polaire. Il semble que le
produit 5 est majoritaire dans le brut réactionnel (le produit 2 est
beaucoup moins visible) mais tous les produits ne révèlent pas avec la
même intensité aux UV.
- On
plonge la plaque dans une solution acide de vanilline (il existe de
nombreux autres révélateurs) et l'on chauffe la plaque jusqu'à ce que des
taches colorées apparaissent. Ici on observe un autre produit (3) qui
n'était pas visible aux UV. La tache 1 est à peine visible ; elle
l'était beaucoup plus sous lampe UV. La surprise vient de la tache
2 : elle n'était que faiblement visible en UV mais elle révèle très
intensément avec la vanilline. Il est fort possible que ce soit le produit
majoritaire de la réaction et non le produit 5 comme le laissait supposer
la détection UV.
Conclusion : il se
produit bien quelque chose lors de cette réaction chimique. Plusieurs produits
sont formés mais l'un (n°2) semble nettement majoritaire. Il faudra refaire une
CCM un peu plus tard pour suivre la disparition de la tache 4 (produit de
départ) dans la colonne B (brut réactionnel) ce qui signifiera que la réaction
est terminée. Ensuite, une chromatographie sur colonne permettra d'isoler les
différents produits et d'effectuer des analyses plus poussées pour s'assurer
que le produit 2 est bien le produit attendu.
Migration
des espèces chimiques
La distance
de migration des produits dépend de leur affinité avec la phase stationnaire et
la phase mobile. Dans l'exemple d'une phase stationnaire polaire (ex : le
gel de silice) et une phase mobile apolaire (ex : hexane), les produits
polaires auront tendance à peu migrer, voire pas du tout alors que les produits
apolaires migreront davantage car entrainés par l'éluant apolaire. Les analytes
passent régulièrement d'une phase à l'autre durant l'élution. L'affinité joue
sur le temps de séjour des analytes dans chaque phase, plus ils ont d'affinité
avec la phase stationnaire, plus ils vont y passer du temps, leur temps de
rétention total va donc être rallongé.
L'éluant
peut être parfois un mélange d'un produit polaire et d'un produit apolaire (par
exemple : dichlorométhane/hexane), ce qui permet de faire légèrement
migrer même les espèces qui ont une affinité avec la phase stationnaire. Ceci a
pour utilité d'éviter que plusieurs produits soient confondus sur la ligne de
base.
La migration
dépend aussi de l'affinité du solvant (polaire, apolaire) avec la phase
stationnaire et la phase mobile.
Elle dépend
également de la concentration de l'espèce.
Les sels ou
autres édifices ioniques ne migrent en général pas du tout et restent sur la
ligne de base.
Rapport
frontal
Le rapport
frontal d'un composé est le rapport de la distance ligne de dépôt-composé sur
la distance ligne de dépôt-front de solvant. Il est compris entre 0 et 1, et
est caractéristique du composé, du matériau de la plaque et du système
d'éluant.
Révélateurs
lien vers le
site du Club de Chromatographie sur Couche Mince :
http://www.clubdeccm.com/PDF/Dyeing_Reagents_TLC.pdf ce document PDF très
complet donne une description exhaustive (appuyée de références
bibliographiques) de 335 révélateurs.
Révélation
au permanganate de potassium
- 10 g de
K2CO3
- 1,5 g
de Permanganate de potassium (KMnO4)
- 150 ml
d'eau distillée
- 1,25 ml
d'Hydroxyde de sodium (NaOH) en solution à 10 %
Astuces
Eviter la
marque au front de migration
Bien
souvent, les plaques commerciales sont recouvertes d'un produit (gel de
silice), qui vient perturber la révélation. En effet, on se retrouve bien
souvent avec une ligne au niveau de ce front. Elle est souvent considérée (à
tort) comme la marque des solvants utilisés. Mais une méthode simple pour
eviter ce phénomène est de faire migrer intégralement la plaque dans le système
de solvant que l'on va utiliser par la suite et de la laisser bien sécher avant
utilisation. L'avantage principal de cette technique est de permettre de voir
plus clairement si des produits ont migré sans être retenus par la phase
solide.
Affiner les
dépôts
Un dépôt
idéal est une ligne fine faite en une seule fois. Cependant, en fonction de
l'origine du produit déposé, cela n'est pas forcément facile. On peut utiliser
un solvant fort (acétone/méthanol 90:10 sur de la silice par exemple) que l'on
va utiliser pour faire migrer l'intégralité la fraction déposée et ce seulement
sur quelques millimètres. Ainsi on se retrouve bien souvent avec une ligne bien
nette ce qui permet de discriminer plus facilement des produits ayant des
comportements relativement proches sur la plaque. Il faut par contre s'assurer
séchage complet de la plaque avant de poursuivre avec le développement.
Découpage d'une
plaque souple
Les plaques
sur support souple sont faites pour être découpées. Cependant, la phase solide
se détache facilement de ce support, et au moment de la découpe s'émiette
provoquant ainsi divers artefacts lors du développement de la plaque (effets de
bord dans lesquels un côté de la plaque va migrer plus vite que l'autre). Pour
éviter cela, lors de la découpe, on peut pencher les ciseaux à 45° dans le sens
des aiguilles d'une montre (pour des ciseaux droitiers, l'inverse pour des
gauchers) dans l'axe de la découpe.
أ- A + B ---- Cالسرعة المتوسطة :
